《Biofabrication》：控制細胞排列的生物3D打印可用于肌腱分化
時間：2023-08-11 14:12 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
生物3D打印是一種能夠精確、受控地沉積細胞和人工細胞外基質(ECM)以創建功能性組織結構的技術。然而，當前的生物打印方法仍然難以獲得機械穩定且獨特的細胞形態結構，例如完全對齊的細胞。近日，來自韓國成均館大學生物醫學融合研究所的GeunHyung
Kim團隊提出了一種新的生物打印方法，可以在細胞中獲得增強的機械強度，而不會失去生物活性或單軸排列細胞的地形線索。首先，將含有細胞的dECM溶液填充到聚乳酸(PLA)模具中，然后在溶液中打印不含細胞的高濃度dECM生物墨水（作為機械支撐）（圖1）。通過這個過程，打印的支柱可以通過拖曳力誘導浴生物墨水中的細胞對齊，同時，沒有細胞的叉指式打印的支柱可以充當機械支撐。
相關研究論文以“Bioprinted hASC-laden cell constructs with mechanically stable and cell alignment cue for tenogenic differentiation”為題于2023年7月25日發表在《Biofabrication》上。
為了證明這一過程的可行性，作者使用了人類脂肪干細胞(hASC)和源自豬肌腱的基質dECM生物墨水，該生物墨水適合再生肌腱組織，因為定向肌腱細胞促進I型和III型膠原基質的形成和一些關鍵的肌腱蛋白。使用該生物打印系統制造的細胞構建體表現出可控的機械特性和顯著增強的細胞活性，包括單軸排列的細胞形態和肌腱基因表達（圖1）。
1. 改進的生物打印策略和dECM生物墨水
為了將所提出的生物打印方法應用于對齊的典型肌肉骨骼組織（肌腱），作者使用源自豬肌腱dECM作為生物墨水。圖2A顯示了從豬腱中提取t-dECM的過程，還定量測量了天然組織和t-dECM中的DNA含量（圖2B）以及生物活性成分彈性蛋白（圖2C）、膠原蛋白（圖2D）和 GAG（圖2E）。結果表明t-dECM中的生物活性成分得到了很好的保留。為了觀察t-dECM對肌腱分化的生化作用，使用膠原蛋白作為對照，并使用載有hASC的t-dECM生物墨水。圖2G顯示肌腱特異性分化（Scx和Tnmd）的免疫熒光圖像。圖2H還顯示了肌腱相關基因的表達（Scx、Tnmd、Col3a1），表明肌腱分化。由于t-dECM的多種肌腱特異性生化成分，與充滿細胞的膠原蛋白生物墨水相比，使用tdECM的生物墨水顯然誘導了更高的基因表達水平。
2. 打印因素對具有合理細胞排列的混合細胞結構的制造的影響
在所提出的打印過程拖流中，由于打印噴嘴和支柱產生的剪切力，t-dECM分子可以被拉長并沿流動方向排列。打印支柱附近的速度梯度導致負載細胞平行于流動方向排列，從而形成梯度排列的細胞。因此，可以通過調整PLA模具中填充的t-dECM生物墨水的粘度、噴嘴移動速度和打印支柱之間的距離等參數來控制細胞排列（圖3）。結果表明，優化后的打印參數可以確保細胞結構表現出良好的排列和機械性能，所得結構表現出優異的細胞排列和高初始細胞活力，表明該過程的安全性。
3. 具有對齊細胞和隨機分布細胞的充滿細胞的構建體的制造
接著，作者展示了具有兩種不同細胞形態結構（對齊（AL）和隨機（RD））的充滿細胞的構建體的制造示意圖，用于研究細胞對齊的效果hASC 的細胞活性。圖4A和B顯示AL和RD構建體的SEM、第1天的活/死以及第3天的鬼筆環肽染色圖像，以觀察t-dECM形態結構、細胞活力和F-肌動蛋白方向。SEM表明AL結構的原纖維化膠原蛋白與打印方向完全對齊，而在RD中的構建體，原纖維化膠原隨機分布。此外，根據活/死圖像確定的初始細胞活力顯示出非常高的值(>90%)，并且兩種結構的值相似（圖4C）。作者還評估了Factin的對齊分數，并且AL-構建體在打印方向上表現出比RD-構建體更大的F-肌動蛋白對齊，這表明在AL-構建體上培養的細胞由于印刷過程的細胞對齊方法，構建體比RD構建體上的那些更加對齊（圖4D）。
4. 負載細胞的構建體的體外細胞活性
一般來說，SCX基因在肌腱和韌帶的發育和再生中起著至關重要的作用，而TNMD對于這些組織的正確形成和成熟以及維持其機械特性和功能是必需的。因此，作者進一步對其進行了驗證。免疫熒光圖像表明，AL構建體中的SCX和TNMD比通過打印細胞排列過程獲得的RD構建體中更發達（圖5A-B）。基因表達檢測也是類似的結果，AL構建體比RD構建體具有更高的與肌腱形成相關的基因表達（圖5C）。這可能是由于新的打印策略誘導了細胞間相互作用的增加，這對于肌腱分化是必需的。此外，在原位打印和細胞培養10天和21天后測量了打印的混合結構的拉伸性能。如圖5D所示，盡管生物墨水中使用了相同的生物墨水成分、印刷的混合結構和細胞數量，但在21天時，AL構建體中觀察到的楊氏模量比RD構建體中的楊氏模量大得多。
5. 混合細胞結構的機械特性
細胞構建體較差的機械性能阻礙了它們在各種組織再生應用中的使用。為了解決這個問題，作者使用不含細胞的甲基丙烯酸酯t-dECMP (t-dECMP-Ma)生物墨水作為混合細胞負載結構中的機械支撐。通過選擇合適的光交聯和印刷條件表明UV交聯過程不會影響t-dECMM中的細胞對齊生物墨水（圖6）。在當前的研究中，利用兩種生物活性水凝膠來實現對齊的充滿細胞的結構，與之前的研究相比，機械性能顯著改善。
綜上，本文使用改進的生物打印工藝成功制造了具有機械穩定且完全排列的細胞的含細胞結構。該過程包括用充滿細胞的生物墨水填充薄模具，并打印生物墨水溶液中不含細胞的高濃度生物墨水。打印參數經過精心選擇，以確保細胞結構表現出良好的排列和機械性能。所得結構表現出優異的細胞排列和高初始細胞活力，表明該過程的安全性。該研究所提出的生物打印細胞結構是一種有前途的生物材料，可用于再生具有機械穩定性的對齊組織結構。
文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ace740
相關研究論文以“Bioprinted hASC-laden cell constructs with mechanically stable and cell alignment cue for tenogenic differentiation”為題于2023年7月25日發表在《Biofabrication》上。
圖1 載有hASC的dECM水凝膠的3D打印過程
為了證明這一過程的可行性，作者使用了人類脂肪干細胞(hASC)和源自豬肌腱的基質dECM生物墨水，該生物墨水適合再生肌腱組織，因為定向肌腱細胞促進I型和III型膠原基質的形成和一些關鍵的肌腱蛋白。使用該生物打印系統制造的細胞構建體表現出可控的機械特性和顯著增強的細胞活性，包括單軸排列的細胞形態和肌腱基因表達（圖1）。
1. 改進的生物打印策略和dECM生物墨水
為了將所提出的生物打印方法應用于對齊的典型肌肉骨骼組織（肌腱），作者使用源自豬肌腱dECM作為生物墨水。圖2A顯示了從豬腱中提取t-dECM的過程，還定量測量了天然組織和t-dECM中的DNA含量（圖2B）以及生物活性成分彈性蛋白（圖2C）、膠原蛋白（圖2D）和 GAG（圖2E）。結果表明t-dECM中的生物活性成分得到了很好的保留。為了觀察t-dECM對肌腱分化的生化作用，使用膠原蛋白作為對照，并使用載有hASC的t-dECM生物墨水。圖2G顯示肌腱特異性分化（Scx和Tnmd）的免疫熒光圖像。圖2H還顯示了肌腱相關基因的表達（Scx、Tnmd、Col3a1），表明肌腱分化。由于t-dECM的多種肌腱特異性生化成分，與充滿細胞的膠原蛋白生物墨水相比，使用tdECM的生物墨水顯然誘導了更高的基因表達水平。
圖2 tdECM的獲取、特性及其生物墨水誘導肌腱能力
2. 打印因素對具有合理細胞排列的混合細胞結構的制造的影響
在所提出的打印過程拖流中，由于打印噴嘴和支柱產生的剪切力，t-dECM分子可以被拉長并沿流動方向排列。打印支柱附近的速度梯度導致負載細胞平行于流動方向排列，從而形成梯度排列的細胞。因此，可以通過調整PLA模具中填充的t-dECM生物墨水的粘度、噴嘴移動速度和打印支柱之間的距離等參數來控制細胞排列（圖3）。結果表明，優化后的打印參數可以確保細胞結構表現出良好的排列和機械性能，所得結構表現出優異的細胞排列和高初始細胞活力，表明該過程的安全性。
圖3 打印因素對細胞排列的影響
3. 具有對齊細胞和隨機分布細胞的充滿細胞的構建體的制造
接著，作者展示了具有兩種不同細胞形態結構（對齊（AL）和隨機（RD））的充滿細胞的構建體的制造示意圖，用于研究細胞對齊的效果hASC 的細胞活性。圖4A和B顯示AL和RD構建體的SEM、第1天的活/死以及第3天的鬼筆環肽染色圖像，以觀察t-dECM形態結構、細胞活力和F-肌動蛋白方向。SEM表明AL結構的原纖維化膠原蛋白與打印方向完全對齊，而在RD中的構建體，原纖維化膠原隨機分布。此外，根據活/死圖像確定的初始細胞活力顯示出非常高的值(>90%)，并且兩種結構的值相似（圖4C）。作者還評估了Factin的對齊分數，并且AL-構建體在打印方向上表現出比RD-構建體更大的F-肌動蛋白對齊，這表明在AL-構建體上培養的細胞由于印刷過程的細胞對齊方法，構建體比RD構建體上的那些更加對齊（圖4D）。
圖4 混合結構中對齊細胞(AL)和隨機分布細胞(RD)的制造過程示意圖及其特點
4. 負載細胞的構建體的體外細胞活性
一般來說，SCX基因在肌腱和韌帶的發育和再生中起著至關重要的作用，而TNMD對于這些組織的正確形成和成熟以及維持其機械特性和功能是必需的。因此，作者進一步對其進行了驗證。免疫熒光圖像表明，AL構建體中的SCX和TNMD比通過打印細胞排列過程獲得的RD構建體中更發達（圖5A-B）。基因表達檢測也是類似的結果，AL構建體比RD構建體具有更高的與肌腱形成相關的基因表達（圖5C）。這可能是由于新的打印策略誘導了細胞間相互作用的增加，這對于肌腱分化是必需的。此外，在原位打印和細胞培養10天和21天后測量了打印的混合結構的拉伸性能。如圖5D所示，盡管生物墨水中使用了相同的生物墨水成分、印刷的混合結構和細胞數量，但在21天時，AL構建體中觀察到的楊氏模量比RD構建體中的楊氏模量大得多。
圖5 負載細胞的構建體的細胞檢測
5. 混合細胞結構的機械特性
細胞構建體較差的機械性能阻礙了它們在各種組織再生應用中的使用。為了解決這個問題，作者使用不含細胞的甲基丙烯酸酯t-dECMP (t-dECMP-Ma)生物墨水作為混合細胞負載結構中的機械支撐。通過選擇合適的光交聯和印刷條件表明UV交聯過程不會影響t-dECMM中的細胞對齊生物墨水（圖6）。在當前的研究中，利用兩種生物活性水凝膠來實現對齊的充滿細胞的結構，與之前的研究相比，機械性能顯著改善。
綜上，本文使用改進的生物打印工藝成功制造了具有機械穩定且完全排列的細胞的含細胞結構。該過程包括用充滿細胞的生物墨水填充薄模具，并打印生物墨水溶液中不含細胞的高濃度生物墨水。打印參數經過精心選擇，以確保細胞結構表現出良好的排列和機械性能。所得結構表現出優異的細胞排列和高初始細胞活力，表明該過程的安全性。該研究所提出的生物打印細胞結構是一種有前途的生物材料，可用于再生具有機械穩定性的對齊組織結構。
文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ace740
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