具有增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度和生物活性的3D生物打印組織工程骨(2)
時(shí)間：2024-09-05 09:20 來源： EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
【免疫調(diào)節(jié)特性】
為評估組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)特性，本文從大鼠外周血中提取單核細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。提取的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體無定形，胞質(zhì)相對均勻。流式細(xì)胞分析顯示，94.5%的細(xì)胞表達(dá)M0巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD68和CD11b，確認(rèn)成功提取并誘導(dǎo)了大鼠M0巨噬細(xì)胞。隨后，使用脂多糖(LPS)將M0巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)后與組織工程骨共培養(yǎng)(圖6a)。WB和qPCR分析顯示，在NC組中，經(jīng)過LPS處理后，隨著時(shí)間的增加，促炎介質(zhì)(iNOS, TNF-α)的相對表達(dá)水平略有增加，其中細(xì)胞主要表現(xiàn)出M1表型(圖6b-d)。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，盡管第一天沒有觀察到明顯的促炎介質(zhì)表達(dá)減少，但隨著時(shí)間的推移記錄到了逐漸減少，第三天效果最為顯著。促炎介質(zhì)表達(dá)水平的降低在SE組中最為顯著，而與E組相比，Si組對促炎反應(yīng)的抑制更為明顯。關(guān)于抗炎介質(zhì)(ARG-1, IL-10)的表達(dá)，在關(guān)鍵的第三天觀察到顯著差異，SE組顯示出最強(qiáng)的效果(圖6b-f)。
圖6 3D生物打印新型組織工程骨中免疫調(diào)節(jié)特性的評估
【免疫調(diào)節(jié)特性的分子機(jī)制初步探索】
為探索免疫調(diào)節(jié)特性的具體機(jī)制，對共培養(yǎng)三天的細(xì)胞進(jìn)行了基因測序。火山圖(圖7a-c,e)和復(fù)雜熱圖(圖7b-d,f)顯示了組間基因表達(dá)的顯著差異。隨后，通過將每組的差異表達(dá)基因與潛在的巨噬細(xì)胞靶點(diǎn)相交，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出按度值排名的前100個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)富集分析。從圖7g-i可以看出，三組的基因本體（GO）富集分析顯示，“炎癥反應(yīng)”和“免疫反應(yīng)”在生物過程術(shù)語中顯著富集；“胞漿、細(xì)胞外空間、分泌、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面”在細(xì)胞組分術(shù)語中富集；“生長因子和細(xì)胞因子”在分子功能術(shù)語中富集。此外，KEGG通路分析表明，“TNF、IL-17和Toll樣受體信號通路”在所有實(shí)驗(yàn)組中都得到了富集。
圖7 組織工程骨中免疫調(diào)節(jié)特性機(jī)制的初步探索
【揭示并分析組織工程骨在體內(nèi)的順序性免疫調(diào)節(jié)性能】
為了進(jìn)一步研究組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)性能，本文進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。分別構(gòu)建了NC(未植入組)、G組(3D生物打印的GelMA支架)、GB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA組織工程骨)、EB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA組織工程骨)、GSiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA/Si-CaP組織工程骨)和ESiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA/Si-CaP組織工程骨)(圖8a)。將支架和組織工程骨植入到具有關(guān)鍵大小顱骨缺損的大鼠模型中(圖8b)。
圖8 組織工程骨中iNOS的動物模型構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)特性的組織學(xué)分析
在植入后的第1、2、3周，分別對M1和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和CD163進(jìn)行免疫熒光染色，以評估不同組別中M1和M2巨噬細(xì)胞的募集水平(圖8c和9a)。同時(shí)，在第二周和第三周，EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強(qiáng)度明顯低于G組和GB組，表明EB、GSiB和ESiB組對持續(xù)炎癥反應(yīng)的抑制作用(圖8d)。在第一周，含有bdECM-MA的EB和ESiB組顯示出更強(qiáng)的iNOS熒光強(qiáng)度，趨勢為ESiB > EB > G > GSiB > GB > NC(圖8d)。同時(shí)，與其他組相比，EB、GSiB和ESiB組的CD163熒光強(qiáng)度適度增加(圖9b)。此外，在第二周觀察到更明顯的趨勢，ESiB > GSiB和EB > GB、G和NC，而在第三周，CD163的表達(dá)趨勢轉(zhuǎn)變?yōu)镋SiB、GSiB和EB > GB、G和NC(圖9b)。隨著時(shí)間的推移，NC、G和GB組的iNOS熒光強(qiáng)度逐漸增加，而EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強(qiáng)度逐漸降低(圖8e)。在NC、G和GB組中，CD163熒光強(qiáng)度較低，而在EB和ESiB組中，CD163熒光強(qiáng)度依次降低，第二周 > 第三周 > 第一周(圖9c)。在GSiB組中，CD163熒光強(qiáng)度保持持續(xù)高表達(dá)，在第一周、第二周和第三周之間沒有顯著差異(圖9c)。然而，在體外實(shí)驗(yàn)中，特別是在SE組中，促炎介質(zhì)的表達(dá)在早期并未觀察到組間的顯著差異，其表達(dá)量并不高于NC組。此外，抗炎介質(zhì)在早期并未表現(xiàn)出表達(dá)增加，隨后隨時(shí)間降低的趨勢，特別是在EB和ESiB組中。
圖9 組織工程骨中CD163的免疫調(diào)節(jié)特性組織學(xué)分析
圖10 組織工程骨的體內(nèi)血管生成與成骨作用
【總結(jié)與展望】
本文開發(fā)了一種具有高細(xì)胞活性和優(yōu)異機(jī)械強(qiáng)度的新型組織工程骨，能夠通過順序免疫調(diào)節(jié)顯著刺激骨再生。該組織工程骨是通過將Si-CaP和BMSCs結(jié)合到bdECM-MA中，利用一系列創(chuàng)新技術(shù)合成，并通過DLP生物打印制造的。通過材料間的靜電排斥作用，組織工程骨實(shí)現(xiàn)了MPa級別的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)保持了高細(xì)胞活性。此外，由于bdECM-MA和Si-CaP的協(xié)同作用，該工程骨展現(xiàn)出了出色的成骨和成血管活性以及增強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力。促成成骨和成血管活性的分子機(jī)制涉及TLR4–PI3K–AKT通路的激活，從而促進(jìn)成骨-成血管耦合。免疫調(diào)節(jié)功能的分子機(jī)制之一涉及對p38-MAPK通路的抑制。本研究的一個(gè)首創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)是組織工程骨的免疫調(diào)節(jié)特性，即順序激活促炎和抗炎反應(yīng)。據(jù)我們所知，這是首次在基于天然生物材料的組織工程骨中展示這一特性。得益于其出色的成骨和成血管活性以及順序免疫調(diào)節(jié)特性，新型組織工程骨顯著加速了大尺寸骨缺損的愈合。盡管具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，但本研究獲得的見解為組織工程和骨免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域的持續(xù)討論提供了有價(jià)值的視角。
文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202401919
(責(zé)任編輯：admin)
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