具有增強機械強度和生物活性的3D生物打印組織工程骨(2)
時間：2024-09-05 09:20 來源： EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
【免疫調節特性】
為評估組織工程骨的免疫調節特性，本文從大鼠外周血中提取單核細胞并誘導其分化為巨噬細胞。提取的細胞呈圓形或橢圓形，細胞體無定形，胞質相對均勻。流式細胞分析顯示，94.5%的細胞表達M0巨噬細胞表面標志物CD68和CD11b，確認成功提取并誘導了大鼠M0巨噬細胞。隨后，使用脂多糖(LPS)將M0巨噬細胞誘導為M1巨噬細胞，誘導后與組織工程骨共培養(圖6a)。WB和qPCR分析顯示，在NC組中，經過LPS處理后，隨著時間的增加，促炎介質(iNOS, TNF-α)的相對表達水平略有增加，其中細胞主要表現出M1表型(圖6b-d)。在三個實驗組中，盡管第一天沒有觀察到明顯的促炎介質表達減少，但隨著時間的推移記錄到了逐漸減少，第三天效果最為顯著。促炎介質表達水平的降低在SE組中最為顯著，而與E組相比，Si組對促炎反應的抑制更為明顯。關于抗炎介質(ARG-1, IL-10)的表達，在關鍵的第三天觀察到顯著差異，SE組顯示出最強的效果(圖6b-f)。
圖6 3D生物打印新型組織工程骨中免疫調節特性的評估
【免疫調節特性的分子機制初步探索】
為探索免疫調節特性的具體機制，對共培養三天的細胞進行了基因測序�；鹕綀D(圖7a-c,e)和復雜熱圖(圖7b-d,f)顯示了組間基因表達的顯著差異。隨后，通過將每組的差異表達基因與潛在的巨噬細胞靶點相交，并構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，篩選出按度值排名的前100個靶點進行后續富集分析。從圖7g-i可以看出，三組的基因本體（GO）富集分析顯示，“炎癥反應”和“免疫反應”在生物過程術語中顯著富集；“胞漿、細胞外空間、分泌、細胞外基質和細胞表面”在細胞組分術語中富集；“生長因子和細胞因子”在分子功能術語中富集。此外，KEGG通路分析表明，“TNF、IL-17和Toll樣受體信號通路”在所有實驗組中都得到了富集。
圖7 組織工程骨中免疫調節特性機制的初步探索
【揭示并分析組織工程骨在體內的順序性免疫調節性能】
為了進一步研究組織工程骨的免疫調節性能，本文進行了體內實驗。分別構建了NC(未植入組)、G組(3D生物打印的GelMA支架)、GB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA組織工程骨)、EB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA組織工程骨)、GSiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的GelMA/Si-CaP組織工程骨)和ESiB組(3D生物打印嵌入BMSCs的bdECM-MA/Si-CaP組織工程骨)(圖8a)。將支架和組織工程骨植入到具有關鍵大小顱骨缺損的大鼠模型中(圖8b)。
圖8 組織工程骨中iNOS的動物模型構建及免疫調節特性的組織學分析
在植入后的第1、2、3周，分別對M1和M2巨噬細胞標志物iNOS和CD163進行免疫熒光染色，以評估不同組別中M1和M2巨噬細胞的募集水平(圖8c和9a)。同時，在第二周和第三周，EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強度明顯低于G組和GB組，表明EB、GSiB和ESiB組對持續炎癥反應的抑制作用(圖8d)。在第一周，含有bdECM-MA的EB和ESiB組顯示出更強的iNOS熒光強度，趨勢為ESiB > EB > G > GSiB > GB > NC(圖8d)。同時，與其他組相比，EB、GSiB和ESiB組的CD163熒光強度適度增加(圖9b)。此外，在第二周觀察到更明顯的趨勢，ESiB > GSiB和EB > GB、G和NC，而在第三周，CD163的表達趨勢轉變為ESiB、GSiB和EB > GB、G和NC(圖9b)。隨著時間的推移，NC、G和GB組的iNOS熒光強度逐漸增加，而EB、GSiB和ESiB組的iNOS熒光強度逐漸降低(圖8e)。在NC、G和GB組中，CD163熒光強度較低，而在EB和ESiB組中，CD163熒光強度依次降低，第二周 > 第三周 > 第一周(圖9c)。在GSiB組中，CD163熒光強度保持持續高表達，在第一周、第二周和第三周之間沒有顯著差異(圖9c)。然而，在體外實驗中，特別是在SE組中，促炎介質的表達在早期并未觀察到組間的顯著差異，其表達量并不高于NC組。此外，抗炎介質在早期并未表現出表達增加，隨后隨時間降低的趨勢，特別是在EB和ESiB組中。
圖9 組織工程骨中CD163的免疫調節特性組織學分析
圖10 組織工程骨的體內血管生成與成骨作用
【總結與展望】
本文開發了一種具有高細胞活性和優異機械強度的新型組織工程骨，能夠通過順序免疫調節顯著刺激骨再生。該組織工程骨是通過將Si-CaP和BMSCs結合到bdECM-MA中，利用一系列創新技術合成，并通過DLP生物打印制造的。通過材料間的靜電排斥作用，組織工程骨實現了MPa級別的機械強度，同時保持了高細胞活性。此外，由于bdECM-MA和Si-CaP的協同作用，該工程骨展現出了出色的成骨和成血管活性以及增強的免疫調節能力。促成成骨和成血管活性的分子機制涉及TLR4–PI3K–AKT通路的激活，從而促進成骨-成血管耦合。免疫調節功能的分子機制之一涉及對p38-MAPK通路的抑制。本研究的一個首創性發現是組織工程骨的免疫調節特性，即順序激活促炎和抗炎反應。據我們所知，這是首次在基于天然生物材料的組織工程骨中展示這一特性。得益于其出色的成骨和成血管活性以及順序免疫調節特性，新型組織工程骨顯著加速了大尺寸骨缺損的愈合。盡管具體的分子機制仍需進一步研究，但本研究獲得的見解為組織工程和骨免疫調節領域的持續討論提供了有價值的視角。
文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202401919
(責任編輯：admin)
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