大量段骨缺損是臨床上的難題，常導致不愈合、植入物失敗等問題。傳統的Ti-6Al-4V骨植入物缺乏促進骨再生所需的松質骨結構和促血管生成信號。近日，來自南方醫科大學黃文華教授、胡孔和、吳耀彬團隊聯合暨南大學Shiyu Li共同設計了一種結合3D打印技術和微流控技術的雙仿生策略，通過制備3D打印鈦合金支架（BTPS）與負載缺氧誘導外泌體的雙網絡水凝膠微球（PGHExo），有效解決了傳統 Ti-6Al-4V骨植入物的應力屏蔽和生物活性有限的問題，顯著增強了體外的成骨和血管生成能力，并在體內實驗中提高了骨量、骨密度和新生血管化，為臨床骨缺損修復提供了有前景的解決方案（圖1）。相關研究成果以“3D-Printed Titanium Trabecular Scaffolds with Sustained Release of Hypoxia-Induced Exosomes for Dual-Mimetic Bone Regeneration”為題于2025年5月11日發表在《Advanced Science》上。
 

1.BTPS的設計、制造和表征
作者首先描述了生物仿生松質骨結構（BTPS）的設計、制造和表征過程。作者利用沃羅諾伊算法結合影像數據設計出模仿股骨松質骨解剖結構的BTPS，其具有600微米的孔徑和70%的孔隙率，展現出各向異性和相互連通的多孔結構，實現了與自然骨結構的高度相似性。通過選擇性激光熔化（SLM）技術成功制造了這種具有生物仿生多孔松質骨設計的Ti-6Al-4V支架（圖2A）。對BTPS的結構和組成進行了全面評估，SEM成像顯示BTPS表面光滑、孔壁厚度均勻（圖2B、C），EDS驗證了該支架主要由鈦（Ti）、鋁（Al）和釩（V）組成（圖2D）；工業CT掃描驗證了內部完整性和連通性，孔徑分析顯示平均孔徑為560微米，平均松質骨厚度為248微米（圖2E-J）。結果表明BTPS實現了預期的結構精度和均勻性，其彈性模量約為3.2 GPa，滲透率為11.52 × 10⁻⁸ mm²，與自然骨的力學性能和滲透性相匹配。
 

2.BTPS的有限元分析、力學測試和流體動力學分析
進一步，作者對BTPS進行有限元分析、力學測試和流體動力學分析的過程。通過有限元分析評估了BTPS在受載情況下的力學穩定性，結果顯示最大應力為454.26 MPa，應力分布均勻，最大位移為0.005 mm，表明BTPS具有良好的變形抗力（圖3A-C）。流體動力學評估了BTPS的滲透性和流體傳輸特性，結果顯示BTPS內流速均勻，流體順暢通過孔隙結構，無湍流或停滯現象，滲透率為11.52 × 10⁻⁸ mm²，表明其具有較高的流體傳輸能力（圖3D-H）。物理力學測試進一步驗證了BTPS的力學性能，其彈性模量為3.2 GPa，與松質骨和皮質骨的彈性模量范圍相符，且平均屈服壓縮載荷為3085.25 N，表明BTPS具有足夠的力學強度以支持骨組織修復和維持結構完整性（圖3I-L）。
 

3.外泌體的提取及表征
接著，作者從人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中提取外泌體并對其進行了表征。通過多步高速離心法成功提取了常氧和缺氧條件下的HUVECs來源的外泌體（圖4A）。免疫熒光染色顯示缺氧顯著提高了HUVECs中VEGFA的表達（圖4B）。定量分析表明，缺氧外泌體（Hypo-Exos）的蛋白濃度顯著高于常氧外泌體（圖4C）。蛋白印跡分析進一步驗證了外泌體標記物ALIX、CD9和CD81的存在，證實了外泌體的純度和身份（圖4D）。TEM表明外泌體呈現典型的圓形形態，平均直徑約為100納米（圖4E）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示Hypo-Exos的顆粒濃度高于常氧外泌體，但兩者在100-150納米范圍內的粒徑分布相似（圖4F）。隨著時間推移，PKH26標記的外泌體被受體細胞攝取，其中Hypo-Exos在72小時的攝取量顯著更高（圖4G）。此外，研究還發現Hypo-Exos在50-200 μg mL⁻¹的濃度范圍內具有劑量依賴性的促血管生成潛力，其中200 μg mL⁻¹組表現出最顯著的血管結構形成（圖4H-I）。
 

4.雙網絡水凝膠緩釋微球的制備、表征和釋放特性
    隨后，作者通過微流控芯片技術成功制備了負載缺氧誘導外泌體（Hypo-Exos）的雙網絡水凝膠微球（PGHExo），并對其進行了表征。作者發現PGHExo微球表面光滑、內部結構均勻，粒徑分布集中且平均粒徑約為80微米（圖5A、C、D）。流變學分析表明，與單組分GelMA凝膠相比，PEGDA/GelMA雙網絡凝膠具有更高的儲能模量和損耗模量，顯示出更好的力學穩定性（圖5B）。在蛋白釋放特性方面，不含Hypo-Exos的PG樣本在18天內幾乎無蛋白釋放，而含Hypo-Exos的樣本則表現出持續的蛋白釋放，且釋放速率與Hypo-Exos濃度正相關（圖5E）。特別地，PGHExo2（含2 mg mL⁻¹ Hypo-Exos）在18天內持續釋放，平均釋放濃度約200 μg mL⁻¹，該濃度是誘導血管生成的最佳濃度（圖5F）。此外，通過共聚焦顯微鏡觀察PKH26標記的Hypo-Exos釋放情況發現，PGHExo2微球能持續釋放Hypo-Exos長達18天（圖5G），免疫熒光成像和定量熒光分析結果一致，證實了雙網絡微球中有效的Hypo-Exo釋放（圖5H）。
 

5.BTPS&pDA@PGHExo的體外生物活性評估
作者在此部分主要描述了BTPS&pDA@PGHExo復合材料的制備過程及其體外生物活性評估。通過等離子體處理和多巴胺涂層（pDA）修飾將PGHExo微球固定在BTPS表面，形成穩定的復合結構（圖6A-D）。SEM和EDS確認了pDA涂層的成功修飾以及PGHExo微球在BTPS表面的良好分布（圖6E-H）。細胞活性實驗表明，BTPS&pDA@PGHExo組展現出顯著更高的細胞活力和增殖能力（圖6I-K，L）。此外，該復合材料還顯著提升了MC3T3-E1細胞的成骨分化能力，表現為更高的堿性磷酸酶（ALP）活性和礦化結節形成能力（圖6M-O）。同時，BTPS&pDA@PGHExo組在促血管生成方面表現出色，表現為血管內皮生長因子（VEGF）等促血管生成基因的顯著上調（圖6P-W）。
 

6.mRNA測序分析
基于其體外良好的生物活性，作者進一步對BTPS&pDA@PGHExo進行了mRNA測序分析，以探究其對基因表達的影響。與對照組相比，BTPS&pDA@PGHExo處理組中有5102個基因表達上調，6049個基因表達下調（圖7A-D）。GO富集分析揭示了關鍵的生物學過程，如線粒體功能、骨形態發生和缺氧誘導的血管生成（圖7E-G）。KEGG通路分析則突出了包括MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF在內的關鍵信號通路，這些通路是成骨和血管生成的重要調控者（圖7H）。通過熱圖分析，作者進一步強調了與骨功能相關的顯著基因（如ALPL、COL18A1、SAMD6和RUNX2OS1）以及與血管生成相關的基因（如VEGFB、PDGFA和ANGPT2）。為了驗證RNA測序結果，作者對關鍵的成骨和血管生成差異表達基因（DEGs）進行了定量實時PCR（qRT-PCR）分析（圖7I,J），結果表明BTPS&pDA@PGHExo組中RUNX2、OCN、PDGF和VEGF的蛋白表達水平顯著增加（圖7K-N）。
 

7.體內骨缺損修復中的應用效果
最后，作者對該復合材料在體內骨缺損修復中的應用效果進行了動物實驗驗證。作者在兔股骨缺損模型中植入了四種不同類型的支架（空對照組、BTPS組、BTPS&pDA@PG組和BTPS&pDA@PGHExo組），并在術后4周和12周分別進行了Micro-CT和組織病理學分析（圖8A-E）。結果顯示，BTPS&pDA@PGHExo組在新骨體積和密度方面顯著高于其他組，特別是在4周時新骨體積達到19.3 mm³，骨密度達到653.9 mg cm⁻³，12周時分別增加至28.1 mm³和717.1 mg cm⁻³（圖8B-E）。組織病理學分析（圖8F-I）進一步揭示了BTPS&pDA@PGHExo組在缺損部位顯著促進了新骨形成和更密集的血管網絡。早期（4周）便觀察到明顯的新生骨和血管，至12周時骨進一步成熟且血管密度增加。定量分析表明，BTPS&pDA@PGHExo組在兩個時間點的新骨體積和血管密度均顯著高于對照組。
 

綜上，本文開發了一種雙仿生策略，將3D打印的生物仿生松質骨結構（BTPS）與負載缺氧誘導外泌體（Hypo-Exos）的雙網絡水凝膠微球（PGHExo）相結合，用于骨組織修復。通過體外和體內實驗表明，這種復合支架能夠顯著增強成骨和血管生成能力，調控關鍵信號通路（如MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF），從而促進骨缺損的修復。在兔股骨缺損模型中，BTPS&pDA@PGHExo組展現出顯著的骨再生和血管化效果，表明該材料有望成為一種臨床應用的骨缺損修復解決方案。

參考資料：
https://doi.org/10.1002/advs.202500599

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