生物打印人體膠質(zhì)母細(xì)胞瘤芯片以鑒定患者對(duì)放化療的特異性反應(yīng)
時(shí)間：2020-02-17 10:46 來(lái)源：南極熊 作者：中國(guó)3D打印網(wǎng) 閱讀：次
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見(jiàn)的腦瘤，約占所有原發(fā)性惡性腦瘤的50%，具有很高的致死率。為了給患者制定一套有效的治療方案，建立患者特定的癌癥模型是一種可靠的臨床決策選擇。病人來(lái)源的腫瘤異種移植動(dòng)物模型已被證明能很好地再現(xiàn)親代腫瘤的特征，但由于建立腫瘤模型所需的時(shí)間長(zhǎng)、成功率低、成本高和倫理問(wèn)題，它們?cè)谂R床上的試驗(yàn)受到了阻礙。而建立反映父代癌癥原始信息的體外腫瘤模型可以克服這些不利因素。目前，體外腫瘤模型在建立一個(gè)包括細(xì)胞和分子多樣性以及腫瘤的生化和生物物理信號(hào)的生理相關(guān)系統(tǒng)方面仍然存在一定的局限性。
因此，Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團(tuán)隊(duì)提出了一種制作具有高度仿生生態(tài)系統(tǒng)的體外腫瘤模型的方法-GBM芯片。該GBM芯片通過(guò)生物3D打印來(lái)自患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞（GBM）、血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的生物墨水（BdECM）制作。經(jīng)過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探究，該芯片的高度異質(zhì)性促成了GBM各種病理特征的出現(xiàn)，與臨床結(jié)果相匹配。并且患者特異性的GBM芯片模型可用于試驗(yàn)優(yōu)越腫瘤殺傷相關(guān)的藥物組合，可能有助于確定對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物耐藥的患者的有效治療方法。
近期發(fā)表在Nature Biomedical Engineering雜志上題為”A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chipfor the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy”的文章，來(lái)自首爾國(guó)立大學(xué)的Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團(tuán)隊(duì)。
為了打印GBM模型芯片，研究團(tuán)隊(duì)首先開(kāi)發(fā)了一種豬腦脫細(xì)胞化的生物墨水（BdECM）。生物墨水在打印時(shí)起到保護(hù)細(xì)胞的封裝載體作用，并在沉積后凝固成為細(xì)胞支撐基質(zhì)。為了評(píng)估這種生物墨水在促進(jìn)GBM細(xì)胞惡性增殖方面的潛力，將其與常用的膠原凝膠進(jìn)行對(duì)比。團(tuán)隊(duì)成員將GBM細(xì)胞進(jìn)行水凝膠包埋培養(yǎng)，以模擬細(xì)胞在三維生物打印過(guò)程后以膠囊形式生長(zhǎng)。最終結(jié)果表明，BdECM中具有更加優(yōu)越的細(xì)胞增值率、相關(guān)基因的高表達(dá)以及紡錘狀的細(xì)胞形態(tài)（圖2）。
然后，根據(jù)GBM的生態(tài)學(xué)特征【GBM以高度致密的球形生長(zhǎng)，沿氧梯度形成解剖上不同的區(qū)域（核心、中間和外圍）。核心區(qū)中的癌細(xì)胞經(jīng)歷嚴(yán)重的缺氧，并形成假透明帶的壞死區(qū)。在中間區(qū)，間變性細(xì)胞過(guò)度增殖，分泌多種細(xì)胞因子以維持生存。結(jié)果，腫瘤周?chē)鷧^(qū)域出現(xiàn)微血管浸潤(rùn)和增生】，打印GBM芯片。芯片的制作過(guò)程如下（輔助視頻1）：（1）在非滲透性玻璃基板上用可滲透硅樹(shù)脂墨水打印腔室壁；（2）為了構(gòu)建GBM模擬結(jié)構(gòu)，首先將填充HUVECs的BdECM生物墨水打印成環(huán)狀；（3）然后打印含有GBM細(xì)胞的BdECM生物油墨，填充BdECM-HUVEC環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，（4）將整個(gè)打印結(jié)構(gòu)固化在加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中，然后用玻璃蓋片覆蓋腔室頂部（圖3）。另外，通過(guò)有限元分析計(jì)算結(jié)合免疫熒光染色法實(shí)驗(yàn)，表征了芯片的氧梯度。
由于芯片上的GBM同時(shí)捕獲了原始癌癥環(huán)境的三個(gè)關(guān)鍵特性：生化特征（類(lèi)似于腦ECM的微環(huán)境）和兩個(gè)物理特征（癌性腫塊的分隔結(jié)構(gòu)，血管化基質(zhì)和氧梯度）。通過(guò)比較不同的環(huán)境特征組合即單元類(lèi)型（SF+,SF-）、氧梯度(GR+,GR-)，我們?cè)u(píng)估了這些特性對(duì)GBM病理生理學(xué)重述的影響（圖4）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表征，SP+ GR+條件（單元化結(jié)構(gòu)、存在氧梯度）比其他條件更能反映腫瘤的重要病理學(xué)特征，包括缺氧誘導(dǎo)的壞死核、假柵欄、細(xì)胞類(lèi)型的空間異質(zhì)性和血管周?chē)h(huán)境。這些數(shù)據(jù)再次支持了BdECM，氧梯度和分隔的組織結(jié)構(gòu)的協(xié)同效應(yīng)對(duì)于概括原始GBM病理生理的重要性。
接下來(lái)，團(tuán)隊(duì)成員利用GBM芯片再現(xiàn)了GBM患者由于藥物抵抗力差異所導(dǎo)致的差異性臨床治療結(jié)果的現(xiàn)象。患者在經(jīng)過(guò)同步放化療（CCRT）加替莫唑胺（TMZ）【標(biāo)準(zhǔn)治療療程】治療后的不同結(jié)果分為3組，即X組患者（a、b和c）表現(xiàn)出低到中等的治療抵抗力，存活時(shí)間>2年；Y組患者（d和e）表現(xiàn)出高的治療抵抗力，存活時(shí)間<1年，Z組患者（f組和g組）在CCRT后經(jīng)歷了惡性腫瘤。鑒于這些臨床結(jié)果，利用上述患者來(lái)源的GBM細(xì)胞制成上述芯片，經(jīng)過(guò)單次CCRT和TMZ治療。有趣的是，X組芯片上的GBM-15、-26和-278細(xì)胞的存活率低于其他組，而Z組芯片上的GBM-28、-37、-51和-103細(xì)胞的存活率顯著高于其他組（圖5），單次治療后從芯片上GBMs獲得的存活率百分比的順序?yàn)閄
最后，團(tuán)隊(duì)成員研究了GBM芯片針對(duì)特定患者的藥物組合效果評(píng)價(jià)。由于患者c在接受CCRT后病情意外惡化，利用該芯片篩選幾種候選藥物組合治療效果（圖6），并以此確定了相對(duì)最佳的治療方案。
圖6 評(píng)估單個(gè)患者對(duì)用不同的藥物組合配合CCRT治療的敏感性
因此，Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團(tuán)隊(duì)提出了一種制作具有高度仿生生態(tài)系統(tǒng)的體外腫瘤模型的方法-GBM芯片。該GBM芯片通過(guò)生物3D打印來(lái)自患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞（GBM）、血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的生物墨水（BdECM）制作。經(jīng)過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探究，該芯片的高度異質(zhì)性促成了GBM各種病理特征的出現(xiàn)，與臨床結(jié)果相匹配。并且患者特異性的GBM芯片模型可用于試驗(yàn)優(yōu)越腫瘤殺傷相關(guān)的藥物組合，可能有助于確定對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物耐藥的患者的有效治療方法。
近期發(fā)表在Nature Biomedical Engineering雜志上題為”A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chipfor the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy”的文章，來(lái)自首爾國(guó)立大學(xué)的Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團(tuán)隊(duì)。
圖1 用于為病人識(shí)別最佳藥物組合的專(zhuān)用GBM芯片的生物打印和使用示意圖。
為了打印GBM模型芯片，研究團(tuán)隊(duì)首先開(kāi)發(fā)了一種豬腦脫細(xì)胞化的生物墨水（BdECM）。生物墨水在打印時(shí)起到保護(hù)細(xì)胞的封裝載體作用，并在沉積后凝固成為細(xì)胞支撐基質(zhì)。為了評(píng)估這種生物墨水在促進(jìn)GBM細(xì)胞惡性增殖方面的潛力，將其與常用的膠原凝膠進(jìn)行對(duì)比。團(tuán)隊(duì)成員將GBM細(xì)胞進(jìn)行水凝膠包埋培養(yǎng)，以模擬細(xì)胞在三維生物打印過(guò)程后以膠囊形式生長(zhǎng)。最終結(jié)果表明，BdECM中具有更加優(yōu)越的細(xì)胞增值率、相關(guān)基因的高表達(dá)以及紡錘狀的細(xì)胞形態(tài)（圖2）。
圖2 BdECM生物墨水的制備與評(píng)價(jià)
然后，根據(jù)GBM的生態(tài)學(xué)特征【GBM以高度致密的球形生長(zhǎng)，沿氧梯度形成解剖上不同的區(qū)域（核心、中間和外圍）。核心區(qū)中的癌細(xì)胞經(jīng)歷嚴(yán)重的缺氧，并形成假透明帶的壞死區(qū)。在中間區(qū)，間變性細(xì)胞過(guò)度增殖，分泌多種細(xì)胞因子以維持生存。結(jié)果，腫瘤周?chē)鷧^(qū)域出現(xiàn)微血管浸潤(rùn)和增生】，打印GBM芯片。芯片的制作過(guò)程如下（輔助視頻1）：（1）在非滲透性玻璃基板上用可滲透硅樹(shù)脂墨水打印腔室壁；（2）為了構(gòu)建GBM模擬結(jié)構(gòu)，首先將填充HUVECs的BdECM生物墨水打印成環(huán)狀；（3）然后打印含有GBM細(xì)胞的BdECM生物油墨，填充BdECM-HUVEC環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，（4）將整個(gè)打印結(jié)構(gòu)固化在加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中，然后用玻璃蓋片覆蓋腔室頂部（圖3）。另外，通過(guò)有限元分析計(jì)算結(jié)合免疫熒光染色法實(shí)驗(yàn)，表征了芯片的氧梯度。
圖3 GBM芯片打印原理以及生態(tài)學(xué)表征
由于芯片上的GBM同時(shí)捕獲了原始癌癥環(huán)境的三個(gè)關(guān)鍵特性：生化特征（類(lèi)似于腦ECM的微環(huán)境）和兩個(gè)物理特征（癌性腫塊的分隔結(jié)構(gòu)，血管化基質(zhì)和氧梯度）。通過(guò)比較不同的環(huán)境特征組合即單元類(lèi)型（SF+,SF-）、氧梯度(GR+,GR-)，我們?cè)u(píng)估了這些特性對(duì)GBM病理生理學(xué)重述的影響（圖4）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表征，SP+ GR+條件（單元化結(jié)構(gòu)、存在氧梯度）比其他條件更能反映腫瘤的重要病理學(xué)特征，包括缺氧誘導(dǎo)的壞死核、假柵欄、細(xì)胞類(lèi)型的空間異質(zhì)性和血管周?chē)h(huán)境。這些數(shù)據(jù)再次支持了BdECM，氧梯度和分隔的組織結(jié)構(gòu)的協(xié)同效應(yīng)對(duì)于概括原始GBM病理生理的重要性。
圖4 生化和生物物理異質(zhì)性對(duì)芯片上GBM病理進(jìn)展的協(xié)同效應(yīng)。
接下來(lái)，團(tuán)隊(duì)成員利用GBM芯片再現(xiàn)了GBM患者由于藥物抵抗力差異所導(dǎo)致的差異性臨床治療結(jié)果的現(xiàn)象。患者在經(jīng)過(guò)同步放化療（CCRT）加替莫唑胺（TMZ）【標(biāo)準(zhǔn)治療療程】治療后的不同結(jié)果分為3組，即X組患者（a、b和c）表現(xiàn)出低到中等的治療抵抗力，存活時(shí)間>2年；Y組患者（d和e）表現(xiàn)出高的治療抵抗力，存活時(shí)間<1年，Z組患者（f組和g組）在CCRT后經(jīng)歷了惡性腫瘤。鑒于這些臨床結(jié)果，利用上述患者來(lái)源的GBM細(xì)胞制成上述芯片，經(jīng)過(guò)單次CCRT和TMZ治療。有趣的是，X組芯片上的GBM-15、-26和-278細(xì)胞的存活率低于其他組，而Z組芯片上的GBM-28、-37、-51和-103細(xì)胞的存活率顯著高于其他組（圖5），單次治療后從芯片上GBMs獲得的存活率百分比的順序?yàn)閄
圖5 患者特異性GBM芯片治療耐藥性差異的臨床再現(xiàn)
最后，團(tuán)隊(duì)成員研究了GBM芯片針對(duì)特定患者的藥物組合效果評(píng)價(jià)。由于患者c在接受CCRT后病情意外惡化，利用該芯片篩選幾種候選藥物組合治療效果（圖6），并以此確定了相對(duì)最佳的治療方案。
圖6 評(píng)估單個(gè)患者對(duì)用不同的藥物組合配合CCRT治療的敏感性
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