哈佛大學醫學院《Science》子刊：利用3D打印治療鈣化主動脈瓣病
時間：2024-03-13 11:41 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
鈣化主動脈瓣病（CAVD）是一種活躍、細胞驅動、進行性疾病，其特征是瓣膜纖維化增厚，隨后發生葉瓣鈣化、瓣膜狹窄，最終導致心力衰竭和死亡。部分原因是由于缺乏適當的實驗模型來幫助我們建立藥物干預發展的分子基礎，目前沒有有效的藥物可供使用。主動脈瓣（AV）葉片由其細胞外基質（ECM）組成的三個不同層次定義：富含膠原的纖維層、富含蛋白多糖的海綿層和富含彈性蛋白的心室層。瓣膜間質細胞（VICs）是AV中最常見的細胞類型。在生理條件下，VICs是靜止的類成纖維細胞樣細胞，并通過增殖和組織重塑維持瓣膜的穩態。然而，在病理條件下，這些VICs變得活化，并轉化為肌成纖維細胞樣細胞或促鈣化的成骨細胞樣細胞，在ECM中積極沉積羥基磷灰石。嵌入在更硬的纖維層中的VICs推動鈣化擴散到海綿層，而相對不受影響的是心室層。因此，能夠在易患疾病的纖維層等環境中研究VICs的能力對于增加對CAVD病理學的理解至關重要。在CAVD中，感受力敏感的瓣膜細胞對纖維化和鈣化引起的組織硬化做出反應，進一步推動病理生理過程。由于缺乏（i）能夠重現這種復雜環境的適當實驗模型以及（ii）對新型工程主動脈瓣（AV）模型性能進行基準測試，目前沒有藥物治療CAVD的藥物。
來自美國哈佛大學醫學院的Elena Aikawa團隊建立了一種基于生物材料的CAVD模型，模擬了人類易患纖維層的生物力學特性，并將其3D生物打印到96孔板中。通過液相色譜串聯質譜分析細胞蛋白質組和囊泡組，比較了3D生物打印模型與傳統的2D單細胞培養模型與人類CAVD組織之間的差異。3D生物打印模型高度重現了CAVD細胞蛋白質組（與2D蛋白質的70%相比，達到94%）。將細胞和囊泡數據集整合起來，識別出與AV鈣化普遍相關的已知和未知蛋白質。本研究探討了2D和3D生物工程系統如何重現人類疾病的獨特方面，將多組學作為一種評估高通量生物工程模型系統的技術，并為未來的藥物發現提供了潛力。相關工作以題為“Intracellular proteomics and extracellular vesiculomics as a metric of disease recapitulation in 3D-bioprinted aortic valve arrays”的文章發表在2024年2月28日的國際頂級期刊《Science Advances》。
1. 創新型研究內容
本研究利用細胞和EV蛋白質組學，通過評估作為靜態生物力學特性的函數發生的細胞和EV蛋白質組水平的變化，全面而整體地表征體外模型對該疾病的重現。此外，本研究還開發、驗證并對CAVD發病機制的3D生物工程模型系統進行基準測試，這些模型系統與高通量藥物篩選平臺兼容。
【高通量生物打印平臺創建了一系列具有生物力學相關性的CAVD模型數組】
本研究采用甲基丙烯酰化明膠和透明質酸（GelMA/HAMA）構建了一個水凝膠系統，其中攜帶有初代人類VICs，并根據AV特定的（和疾病驅動的）生物力學進行調節（圖1A和B）。使用的VICs來自人類CAVD組織樣本。生物打印參數經過優化，以適應適用于高通量篩選的96孔板陣列，顯示出孔井之間的一致性（圖1B和C）。VICs對ECM的硬度有感知和響應能力；因此，對于成功的CAVD模型來說，材料硬度的重現必不可少，與原生主動脈瓣層次相一致。通過調節紫外（UV）固化時間，操控了水凝膠的機械特性，并在96孔板陣列格式中復制了海綿質（受疾病保護）和纖維質（易患疾病）瓣膜層的力學特性，基于先前的研究并通過納米壓痕分析進行了確認（圖1D和E）。納米壓痕測量的熱圖顯示了水凝膠表面上的空間分辨率一致性的生物力學測量結果（圖1D），并通過定量分析重現了已知的層特異性生物力學特性（圖1E）。由于鈣化主要發生在主動脈瓣的纖維質層，因此后續的實驗中使用了類纖維層的水凝膠模型。
通過展示在96孔板生物打印水凝膠陣列中廣泛調節生物力學特性的能力，使其覆蓋一系列（病理）生物學相關的硬度范圍，隨后的實驗專注于與疾病相關的類纖維層水凝膠，重現了易患疾病的主動脈瓣區域的生物力學特性。先前的研究已經顯示，培養14天后，VIC封裝的水凝膠模型在不同培養條件下的鈣化情況存在顯著差異，借此指導了本研究的培養時間表。在正常培養基（NM）或兩種刺激鈣化的培養基：有機磷酸鹽成骨培養基（OM）或無機磷酸鹽促鈣化培養基（PM）中培養14天后，類纖維層水凝膠中的VIC在所有培養基類型和重復實驗中維持了較高的存活率（圖2A，頂部和B，左側）。瓣膜鈣化可以是不同過程的產物，例如類骨母細胞樣VIC的活性礦物沉積，或與細胞凋亡相關的鈣化，后者通常被認為是體外培養的人工過程。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸核苷酸末端標記（TUNEL）染色顯示，在所有水凝膠和培養條件中，幾乎沒有與細胞凋亡相關的細胞死亡，證實鈣化很可能不是由細胞死亡相關的鈣積累介導的（圖2A，底部和B，右側）。通過使用近紅外鈣示蹤劑（Osteosense680）對類纖維層96孔水凝膠陣列中的鈣化進行了評估。所有的3D陣列培養基條件都顯示了一定程度的Osteosense680陽性染色（圖2C）。然而，在OM和PM條件下，微小鈣化灶數量（圖2D）和信號強度（圖2E）均呈上升趨勢，并且在統計上存在顯著增加。
【細胞蛋白質組學鑒定了在3D生物打印陣列中建模的獨特病理過程】
一旦細胞存活和鈣化誘導得到確認，本研究使用基于質譜的蛋白質組學方法評估了3D生物打印的VIC水凝膠CAVD陣列條件下與傳統的2D VIC單細胞培養條件下分別對原生CAVD組織表型的重現能力（CAVD）（圖3A）。在3D和2D條件下，鑒定出了超過2500種蛋白質，兩種體外模型之間的鑒定蛋白質的重疊率超過99%（圖3B）。為了去除培養準備過程中可能產生的潛在背景污染物，本研究還探究了僅含細胞外水凝膠的蛋白質組，并對其與Hathewaya histolytica（膠原酶來源）、豬（GelMA/HAMA來源）、牛（培養血清來源）和人類（用于識別目標蛋白質組同源性）蛋白質組進行了比對（圖3B）。隨后的分析中包括了CAVD組織來源的細胞（圖3C）。未經過濾的主成分分析（PCA）顯示了按模型類型（圖2D）和鈣化培養基處理（圖3E，僅體外）進行的三種蛋白質組的無偏聚類。在2D和3D體外模型之間，測得的蛋白質組中有48%的差異豐度，而CAVD與2D或3D之間的差異豐度不到30%。這表明體外模型的細胞蛋白質組之間的差異比它們與新鮮組織的細胞蛋白質組之間的差異更大（圖3F）。接下來，本研究確定了表征2D和3D條件之間以及體外模型與組織之間關鍵差異的基因本體論（GO）術語（圖3，G'和G"），2D培養中的蛋白質與血小板聚集、同型細胞間粘附、典型糖酵解和肌動蛋白絲解聚相關，而3D培養中的蛋白質與膠原纖維排列、蛋白質N-和O-糖基化、COPI包被小泡運輸以及線粒體組織相關。最后，分離的CAVD細胞中富集了與調節免疫反應、補體激活和糖脂轉運相關的蛋白質（圖3G），與原生CAVD中存在的免疫細胞浸潤一致。
本研究的目標是將體外培養的細胞蛋白質豐度與CAVD來源的細胞蛋白質豐度進行相關性分析。成對相關性分析顯示，所有體外培養基條件之間相關性都很高（r > 0.9）。全面的蛋白質組相關性分析顯示，2D和3D細胞與CAVD細胞之間存在顯著相關性（2D ravg = 0.82；3D ravg = 0.79）。接下來，將2D和3D蛋白質豐度與所有培養基條件下的AV數據集進行比較（圖4B和C）。在2D模型中，與原生CAVD相比，NM是具有最多的差異蛋白質，而PM是具有最少的差異蛋白質（圖4B）；與之不同的是，3D陣列中的細胞蛋白質中很少有與CAVD有差異豐度的蛋白質（圖4C）。總體而言，3D模型在94%的測量蛋白質中重現了CAVD細胞蛋白質豐度的特征，而2D模型則重現了70%的蛋白質豐度。這表明3D模型可能在整體上最適合識別在疾病誘導過程中蛋白質豐度變化，這種變化最接近于在原生組織中觀察到的變化。
接下來，本研究使用蛋白質趨勢分析來確定在2D和3D條件下，哪些關鍵蛋白質最能重現CAVD細胞蛋白質組（圖4D至H）。在2D PM條件下，重現CAVD豐度的蛋白質與細胞粘附（CDH13和ARHGDIB）和細胞骨架組織（PACSIN2、CNN2和THY1）相關（圖4D至F）。在3D條件下，OM和PM培養基都重現了與超分子纖維組織（MFAP4、COL18A1和TMOD1）、脂蛋白代謝（APOA1和APOE）、負調節內皮細胞增殖（SCG2、PDCD10）和脂肪酸β-氧化（ATFA和ECHS1）相關的CAVD蛋白質豐度（圖4G至I）。本研究還發現了一組在所有3D培養基條件下與CAVD組織趨勢一致的蛋白質（圖4G，底部）。這種以細胞蛋白質組為中心的分析無偏地顯示，3D水凝膠陣列重現了在2D單細胞培養中無法捕捉到的疾病的獨特方面。
來自美國哈佛大學醫學院的Elena Aikawa團隊建立了一種基于生物材料的CAVD模型，模擬了人類易患纖維層的生物力學特性，并將其3D生物打印到96孔板中。通過液相色譜串聯質譜分析細胞蛋白質組和囊泡組，比較了3D生物打印模型與傳統的2D單細胞培養模型與人類CAVD組織之間的差異。3D生物打印模型高度重現了CAVD細胞蛋白質組（與2D蛋白質的70%相比，達到94%）。將細胞和囊泡數據集整合起來，識別出與AV鈣化普遍相關的已知和未知蛋白質。本研究探討了2D和3D生物工程系統如何重現人類疾病的獨特方面，將多組學作為一種評估高通量生物工程模型系統的技術，并為未來的藥物發現提供了潛力。相關工作以題為“Intracellular proteomics and extracellular vesiculomics as a metric of disease recapitulation in 3D-bioprinted aortic valve arrays”的文章發表在2024年2月28日的國際頂級期刊《Science Advances》。
1. 創新型研究內容
本研究利用細胞和EV蛋白質組學，通過評估作為靜態生物力學特性的函數發生的細胞和EV蛋白質組水平的變化，全面而整體地表征體外模型對該疾病的重現。此外，本研究還開發、驗證并對CAVD發病機制的3D生物工程模型系統進行基準測試，這些模型系統與高通量藥物篩選平臺兼容。
【高通量生物打印平臺創建了一系列具有生物力學相關性的CAVD模型數組】
本研究采用甲基丙烯酰化明膠和透明質酸（GelMA/HAMA）構建了一個水凝膠系統，其中攜帶有初代人類VICs，并根據AV特定的（和疾病驅動的）生物力學進行調節（圖1A和B）。使用的VICs來自人類CAVD組織樣本。生物打印參數經過優化，以適應適用于高通量篩選的96孔板陣列，顯示出孔井之間的一致性（圖1B和C）。VICs對ECM的硬度有感知和響應能力；因此，對于成功的CAVD模型來說，材料硬度的重現必不可少，與原生主動脈瓣層次相一致。通過調節紫外（UV）固化時間，操控了水凝膠的機械特性，并在96孔板陣列格式中復制了海綿質（受疾病保護）和纖維質（易患疾病）瓣膜層的力學特性，基于先前的研究并通過納米壓痕分析進行了確認（圖1D和E）。納米壓痕測量的熱圖顯示了水凝膠表面上的空間分辨率一致性的生物力學測量結果（圖1D），并通過定量分析重現了已知的層特異性生物力學特性（圖1E）。由于鈣化主要發生在主動脈瓣的纖維質層，因此后續的實驗中使用了類纖維層的水凝膠模型。
圖1 主動脈瓣模型的3D生物打印
通過展示在96孔板生物打印水凝膠陣列中廣泛調節生物力學特性的能力，使其覆蓋一系列（病理）生物學相關的硬度范圍，隨后的實驗專注于與疾病相關的類纖維層水凝膠，重現了易患疾病的主動脈瓣區域的生物力學特性。先前的研究已經顯示，培養14天后，VIC封裝的水凝膠模型在不同培養條件下的鈣化情況存在顯著差異，借此指導了本研究的培養時間表。在正常培養基（NM）或兩種刺激鈣化的培養基：有機磷酸鹽成骨培養基（OM）或無機磷酸鹽促鈣化培養基（PM）中培養14天后，類纖維層水凝膠中的VIC在所有培養基類型和重復實驗中維持了較高的存活率（圖2A，頂部和B，左側）。瓣膜鈣化可以是不同過程的產物，例如類骨母細胞樣VIC的活性礦物沉積，或與細胞凋亡相關的鈣化，后者通常被認為是體外培養的人工過程。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸核苷酸末端標記（TUNEL）染色顯示，在所有水凝膠和培養條件中，幾乎沒有與細胞凋亡相關的細胞死亡，證實鈣化很可能不是由細胞死亡相關的鈣積累介導的（圖2A，底部和B，右側）。通過使用近紅外鈣示蹤劑（Osteosense680）對類纖維層96孔水凝膠陣列中的鈣化進行了評估。所有的3D陣列培養基條件都顯示了一定程度的Osteosense680陽性染色（圖2C）。然而，在OM和PM條件下，微小鈣化灶數量（圖2D）和信號強度（圖2E）均呈上升趨勢，并且在統計上存在顯著增加。
圖2 在有機磷酸鹽和無機磷酸鹽培養基條件下，培養在類纖維層水凝膠中的VICs保持存活，并誘導鈣化
【細胞蛋白質組學鑒定了在3D生物打印陣列中建模的獨特病理過程】
一旦細胞存活和鈣化誘導得到確認，本研究使用基于質譜的蛋白質組學方法評估了3D生物打印的VIC水凝膠CAVD陣列條件下與傳統的2D VIC單細胞培養條件下分別對原生CAVD組織表型的重現能力（CAVD）（圖3A）。在3D和2D條件下，鑒定出了超過2500種蛋白質，兩種體外模型之間的鑒定蛋白質的重疊率超過99%（圖3B）。為了去除培養準備過程中可能產生的潛在背景污染物，本研究還探究了僅含細胞外水凝膠的蛋白質組，并對其與Hathewaya histolytica（膠原酶來源）、豬（GelMA/HAMA來源）、牛（培養血清來源）和人類（用于識別目標蛋白質組同源性）蛋白質組進行了比對（圖3B）。隨后的分析中包括了CAVD組織來源的細胞（圖3C）。未經過濾的主成分分析（PCA）顯示了按模型類型（圖2D）和鈣化培養基處理（圖3E，僅體外）進行的三種蛋白質組的無偏聚類。在2D和3D體外模型之間，測得的蛋白質組中有48%的差異豐度，而CAVD與2D或3D之間的差異豐度不到30%。這表明體外模型的細胞蛋白質組之間的差異比它們與新鮮組織的細胞蛋白質組之間的差異更大（圖3F）。接下來，本研究確定了表征2D和3D條件之間以及體外模型與組織之間關鍵差異的基因本體論（GO）術語（圖3，G'和G"），2D培養中的蛋白質與血小板聚集、同型細胞間粘附、典型糖酵解和肌動蛋白絲解聚相關，而3D培養中的蛋白質與膠原纖維排列、蛋白質N-和O-糖基化、COPI包被小泡運輸以及線粒體組織相關。最后，分離的CAVD細胞中富集了與調節免疫反應、補體激活和糖脂轉運相關的蛋白質（圖3G），與原生CAVD中存在的免疫細胞浸潤一致。
圖3 CAVD水凝膠模型的細胞蛋白質組學揭示了模擬病理過程的轉化靶點
本研究的目標是將體外培養的細胞蛋白質豐度與CAVD來源的細胞蛋白質豐度進行相關性分析。成對相關性分析顯示，所有體外培養基條件之間相關性都很高（r > 0.9）。全面的蛋白質組相關性分析顯示，2D和3D細胞與CAVD細胞之間存在顯著相關性（2D ravg = 0.82；3D ravg = 0.79）。接下來，將2D和3D蛋白質豐度與所有培養基條件下的AV數據集進行比較（圖4B和C）。在2D模型中，與原生CAVD相比，NM是具有最多的差異蛋白質，而PM是具有最少的差異蛋白質（圖4B）；與之不同的是，3D陣列中的細胞蛋白質中很少有與CAVD有差異豐度的蛋白質（圖4C）。總體而言，3D模型在94%的測量蛋白質中重現了CAVD細胞蛋白質豐度的特征，而2D模型則重現了70%的蛋白質豐度。這表明3D模型可能在整體上最適合識別在疾病誘導過程中蛋白質豐度變化，這種變化最接近于在原生組織中觀察到的變化。
接下來，本研究使用蛋白質趨勢分析來確定在2D和3D條件下，哪些關鍵蛋白質最能重現CAVD細胞蛋白質組（圖4D至H）。在2D PM條件下，重現CAVD豐度的蛋白質與細胞粘附（CDH13和ARHGDIB）和細胞骨架組織（PACSIN2、CNN2和THY1）相關（圖4D至F）。在3D條件下，OM和PM培養基都重現了與超分子纖維組織（MFAP4、COL18A1和TMOD1）、脂蛋白代謝（APOA1和APOE）、負調節內皮細胞增殖（SCG2、PDCD10）和脂肪酸β-氧化（ATFA和ECHS1）相關的CAVD蛋白質豐度（圖4G至I）。本研究還發現了一組在所有3D培養基條件下與CAVD組織趨勢一致的蛋白質（圖4G，底部）。這種以細胞蛋白質組為中心的分析無偏地顯示，3D水凝膠陣列重現了在2D單細胞培養中無法捕捉到的疾病的獨特方面。
圖4 3D生物打印模型的細胞蛋白質組能夠最好地重現在鈣化條件下的CAVD細胞病理學
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