一種應用于3D打印的自組裝雙親肽
基于擠出式打印的3D生物打印已被廣泛應用于復制生物體內自然存在的復雜結構，其中生物墨水的性質至關重要，因此墨水材料的開發極具前景。目前使用的生物墨水多由透明質酸、海藻酸鹽及脫細胞基質等天然來源的水凝膠材料組成，或將這些材料通過化學改性的方法進行改良，這種方法可以在保持天然材料原有生物相容性的基礎上增強材料的打印性，使其具有保真度和打印結構的長期穩定性，目前該領域已取得廣泛進展，但單純化學改性的方法仍難保持生物性和打印性的平衡，且不同批次間存在差異，難以保證穩定的打印質量。
自組裝肽(self-assembling peptides, SAPs）因其在材料機械、生物及化學的可設計性被廣泛應用于開發新的生物墨水，SAPs僅由氨基酸組件構成，經過設計的特定SAPs通過超分子組裝成指定結構的納米級多肽，再進一步組裝成宏觀結構的水凝膠，即模塊化的合成過程，可以通過簡單地改變其一級結構序列或加入生物活性肽序列來改變SAPs的性質，因此具有易合成、成分明確及設計靈活性等優勢，可實現的材料性質范圍廣，在擠出式生物打印墨水的開發領域極具吸引力。
研究簡介
來自美國萊斯大學的Jeffrey D. Hartgerink教授團隊將多結構域肽（multidomain peptides, MDPs）作為一種新的生物墨水應用于擠出式3D生物打印以創建復雜結構并實現多材料打印，通過體外實驗揭示了電荷差異對細胞活性及形態的影響，探索并通過調控MDPs內電荷來調節細胞行為。MDPs是一類SAPs，可在生理pH及離子條件下形成納米纖維水凝膠。MDPs具有交替的疏水性和親水性氨基酸的基礎結構，帶電殘基位于兩側，通過帶電離子間相互作用形成“疏水夾層”，從而組裝為β片層結構的有序纖維，并在適當的濃度下快速凝膠化成納米纖維水凝膠，可作為生物墨水應用于擠出式打印。本文使用攜帶相反電荷的兩種MDPs進行3D打印的參數優化以及構建復雜圖形，并在體外通過兩種墨水的組合構建支架以觀察并調控細胞行為。相關工作以題為“3D Printing of Self-Assembling Nanofibrous Multidomain Peptide Hydrogels”的文章發表在2023年1月的《AdvancedMaterials》雜志上。（DOI: 10.1002/adma.202210378）
研究內容
1.多結構域肽的表征
本研究中使用了兩種不同的電荷的MDPs，其中陽離子MDPs序列為K2(SL)6K2，命名為K2，陰離子MDPs序列為E2(SL)6E2，命名為E2。圓二色譜結果顯示K2及E2均表現為β片層特征性結構（圖2a），其中K2序列因賴氨酸上的氨基和谷氨酸上的羧基之間的差異呈現更強的β片層結構。掃描電鏡可見K2及E2水凝膠的纖維結構，低倍鏡下可見兩種水凝膠表面均表現為密集的纖維結構（圖2c、e），高倍鏡下可見兩種水凝膠的網狀結構（圖2d、f）。
2.多結構域肽墨水打印參數優化
為了評估兩種MDPs用于擠出式墨水的可打印性，通過流變學測試評估了肽濃度對水凝膠儲存模量的影響（圖3a、e），在濃度相同的情況下，K2凝膠的儲存模量G‘平均比 E2 凝膠大4.2倍，每增加一個濃度梯度，兩種 MDPs水凝膠的G’都會增加約2倍。在保證溶解度的條件下，通過流變學測試驗證了濃度最高（G‘最高）的MDPs水凝膠的剪切稀化及快速自愈合等3D可打印墨水的基本特性（圖3b、f）。
MDPs的交聯方式與大部分生物墨水材料需要共價交聯不同，MDPs僅依靠超分子力進行組裝，意味著MDPs水凝膠能在打印過程中保持動態組裝的狀態。因此通過使用不同批次MDPs、改變溫度和時間對流變性能的影響驗證MDPs水凝膠的穩定性，對每種水凝膠進行3次重復流變性能測試，結構顯示與初始結果相符（圖3i）。此外，MDPs水凝膠在4-37°C之間顯示出穩定的流變學特性，兩種4%濃度的MDPs水凝膠平均僅產生約5%的變化（圖3j），因此利于在37 °C 條件下體外接種細胞或體內植入支架。MDP水凝膠在4°C下儲存時也表現長期穩定性（圖3k）。在4°C下儲存長達2.5個月后，不同儲存時間長度條件下的水凝膠的流變特性的變化可以忽略不計。與時間敏感型水凝膠相比，MDPs水凝膠具備更大的靈活性和按需使用的能力。
使用Allevi 3生物打印機對4%濃度K2墨水、4%濃度E2墨水和3%濃度K2墨水進行打印參數的優化。以0.5PSI的增量增加壓力至墨水可以呈長絲狀流出以確定最小擠出壓力（圖4a）。從25G針頭擠出的長絲的理想高度和寬度為250μm，即針頭的內徑。纖維在高速打印時會斷裂，最小打印速度為300mm/min，通過此方法可以確定使用不同規格針頭下最佳打印速度。使用最佳的壓力和打印速度可以使三種墨水進行懸垂打印（圖4b）。僅在8mm和16mm的懸伸處觀察到打印結構的輕微偏轉，表明非共價組裝的方式足夠堅固以支撐打印結構，從而避免了共價交聯的需要。4%濃度 K2墨水成功打印出的圓柱體側面光滑，無明顯缺陷（圖4c），進一步可打印出各種復雜分層結構（圖4d-g）。將支架打印后直接在HBSS溶液中孵育24 h，仍保持其結構和內部孔隙率（圖4h）。
3.體外實驗
本研究采用僅由K2支架、E2支架以及第一層為K2，第二層為E2的K2/E2支架接種上C2C12細胞（小鼠成肌細胞）來驗證電荷對細胞的影響。結果顯示與E2支架相比，粘附于K2支架上的細胞更多且增殖情況更佳，細胞在兩種MDPs支架上培養第5天后數量都明顯增多，表明E2支架對于細胞的弱粘附性會減慢其增殖速度但不會阻止增殖。細胞在K2/E2支架上培養10天仍可見高細胞活力，證實了結合了相反電荷的MDPs不會引起細胞毒性，且可見細胞增殖的差異，其中內部K2區域細胞伸展情況佳，而外部 E2區域顯示出較少的匯合度和更多的球形細胞（圖5a、b)。對肌動蛋白染色可觀察到成肌細胞在K2支架上融合成肌管并向多個方向延伸。而E2支架上的細胞體積更小且肌動蛋白絲更少，K2/E2支架上細胞形態由細胞生長區域的支架決定，同時也受到附近帶相反電荷的肽的影響（圖5f），K2區域內細胞的肌動蛋白絲更為散在且觀察到明顯的細胞核聚集。相比之下，E2區域的細胞以球形為主，可以觀察到部分肌動蛋白絲從細胞內伸出，而在僅由E2水凝膠打印的支架中沒有觀察到這種現象。結果表明，K2墨水和E2墨水可以一起使用來調控體外的細胞行為。
亮點總結
1. 通過設計MDPs水凝膠實現了全新的非共價鍵交聯生物墨水用于實現全液體3D打印，打印條件簡單可控，墨水性質穩定堅固且保真度高；
2. MDPs僅由多肽構成，成分簡單明確。且打印過程中無需引入其他交聯劑，非共價鍵交聯的組裝方式保證了水凝膠的生物安全性；
3. MDPs水凝膠的電荷、機械性能等可影響細胞活性及行為的特性皆可被人為設計，因此可成為進一步開發體外細胞實驗的理想候選生物墨水，未來可利用該生物墨水打印更復雜的結構以及探索其他支架特性對各種類型細胞的影響。
(責任編輯：admin)
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